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人间充质干细胞生物学有效性的质量评价
时间:2021-07-22作者:中检联来源:中检联检测

人间充质干细胞( human mesenchymal stem cells,hMSCs) 是一类存在于不同组织间质或血管周围、形态类似于成纤维细胞的成体干细胞。hMSCs 具有独特的、与治疗疾病密切相关的生物学有效性( biological effectiveness) ,因此已成为临床研究中发展最为迅速的一类干细胞。其生物学有效性可归为三大类: 多向分化潜能、免疫调控功能和组织再生功能,而每一类别中又含有细化的内容( 或质量属性) 。生物学有效性是临床前研究阶段 hMSCs 产品综合质量评价的重要内容,而相关质量评价的目的是用于预测或确保相关产品临床治疗有效性的重要依据。由于如何有效预测干细胞临床治疗的有效性是影响其产品研发的重要瓶颈因素,因此对 hMSCs“生物学有效性”的评价在其产品研发中变得非常重要。本文首先总结了目前国际上有关 hMSCs 生物学有效性相关质量属性的共识,进而提出了一些有效评价 hMSCs 生物学有效性不同方面的评价技术和评价策略,以帮助建立综合性 hMSCs 生物学有效性质量评价技术体系。


人间充质干细胞( human mesenchymal stem cells,hMSCs) 具有一定程度的自我复制更新能力、诱导分化潜能、独特的免疫调控功能和组织再生功能,具有广泛的临床应用价值,是目前处于临床研究阶段干细胞类型中发展最为迅速的干细胞类型。


目前 在 美 国 ClinicalTrials. gov 网 站 上 登 记 的hMSCs 临床研究已超过 700 例,所登记的 hMSCs 临床研究主要是利用不同组织来源的 hMSCs 治疗心脑血管疾病、骨关节疾病、糖尿病、神经系统退行性病变、移植物抗宿主性疾病( GvHD) 以及不同组织、器官的功能损伤或衰竭等疾病。


临床应用的 hMSCs 应具有 4 类质量属性,即基本生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性和生物学有效性。其中,hMSCs 的生物学有效性( biological effectiveness) 是指临床前研究阶段,与 hMSCs 临床治疗效应相对应或可用于预测临床治疗效应相关的生物学功能,它是现阶段乃至未来决定 hMSCs 临床转化是否能够成功的重要质量属性。


hMSCs 的生物学有效性,可归纳为三大类,即多向分化潜能、免疫调控功能和组织再生功能。其中,多向分化潜能是指 hMSCs 在特定体外诱导分化培养条件下,具有向内、中、外胚层不同细胞系列( lineages) 分化的潜能; 免疫调控功能是指 hMSCs 可与机体内几乎所有的免疫细胞相互作用并调节其功能,用于改善局部病损组织的微环境、抑制过激的炎症反应或调控异常免疫反应; 而组织再生功能是指相对独立于诱导分化功能和免疫调控功能,直接促进病损组织细胞修复和/或再生的一系列生物学功能的总和。这三大细胞生物学功能是 hMSCs临床研究中各类适应证治疗的重要生物学基础,其表达水平( 或质量水平) 可在一定程度上预测临床治疗的有效性。


不同组织来源的 hMSCs 均具有不同程度的生物学有效性,而不同制备工艺、培养条件和技术、特殊细胞处理方法、细胞培养过程中的隐性微生物或微生物代谢产物污染、细胞体外过度扩增所伴随的细胞老化等因素,都会对 hMSCs 的生物学有效性产生不同程度的影响,进而影响其临床治疗效果。对制备过程中不同阶段的中间细胞,或终末细胞制剂进行生物学有效性检测,可在确保相关细胞产品质量的同时,有效保障其临床应用安全性及有效性。


在长期大量研发工作的基础上,本文对 hMSCs三大类生物学有效性中各关键质量属性及相关的质量评价技术进行了总结,进一步强化了对 hMSCs 综合性生物学有效性质量评价技术体系的认识,明确了其对 hMSCs 相关产品开发实践的指导意义。


1

hMSCs 生物学有效性的

关键质量属性及评价技术


1.1

hMSCs 的分化潜能



hMSCs 可在特定诱导分化条件下,向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等功能细胞分化。在体外质量评价试验中,可以通过特定诱导条件将 hMSCs 向特定功能细胞分化,进而运用不同检测技术对分化细胞的相关生物学特性或功能进行评价。

1.1.1 hMSCs 成骨细胞诱导分化功能评价  hMSCs 在相关诱导分化培养基培养 14 ~ 28 d 后,经茜素红(alizarin red)染色呈阳性,提示成骨诱导分化后细胞内可形成矿化基质(见图1A) 。

1.1.2 hMSCs 成脂肪细胞诱导分化功能评价  hMSCs在相关诱导分化培养基培养 14 ~ 28 d 后,经油红 O( oil red O) 染色为阳性,说明分化的细胞内形成脂滴(见图1B) 。

1.1.3 hMSCs 成软骨细胞诱导分化功能评价  经相关诱导分化培养基处理后,hMSCs 细胞先凝聚成细胞球,再分化形成软骨细胞及软骨组织,其中软骨细胞经番红 O 或阿新蓝染色为阳性( 见图1C 和 D) 。伴随软骨细胞分化,Ⅱ型胶原等软骨细胞特定基因表达水平会显著上调,因此可利用在软骨分化条件下,hMSCs 成细胞球能力、形成软骨组织形态能力、番红 O 或阿新蓝染色及软骨特定基因表达上调情况综合判断 hMSCs 成软骨细胞分化能力。

人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图1) 


1.2

hMSCs 的免疫调控功能



hMSCs 的免疫调控功能是指其在体内炎性微环境中,与各种免疫细胞相互作用,抑制促炎性免疫细胞增殖和/或活性、抑制促炎因子释放,同时促进调节性免疫细胞增殖或极化( polarization),经炎症因子刺激可分泌免疫调控分子[如吲哚胺 2,3-双加氧酶1( indoleamine-2,3-dioxygenase 1,IDO1)]等。

1.2.1 hMSCs 与免疫细胞相互作用  通过 hMSCs与有丝分裂原( 如 PHA 或 ConA 等) 或 CD3 及 CD28抗体诱导活化的 PBMC 共培养,可观察到 hMSCs 抑制 T 淋巴细胞的激活和增殖。在调控不同 T 淋巴细胞亚群方面,hMSCs 可有效抑制促炎性淋巴细胞亚 群 Th1 和 Th17 的 增 殖 和 相 应 细 胞 因 子 分泌,促进 Th17 分化为调节性 T 细胞( Treg)。hMSCs 还可促进巨噬细胞由 M0 型或 M1 型( 促炎型) 向 M2 型( 抑炎型) 方向极化。M2 型巨噬细胞分泌白细胞介素 10( interleukin 10,IL-10) 并高表达 CD206。


hMSCs 抑制人淋巴细胞增殖功能的评价: 目前以羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯( 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE) 标记法作为 hMSCs 抑制淋巴细胞增殖的常规评价方法,该方法可显示,hMSCs 对 PHA 激活的 PBMC 增殖有显著抑制作用,抑制率可达到 80% 以上(见图 2) 。


 人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图2)


hMSCs 抑制促炎性淋巴细胞亚群 Th1 和 Th17功能的评价: 利用 hMSCs 与异体人 PBMC 共培养后,分析淋巴细胞亚群 Th1( CD8-IFN-γ+) 和 Th17( CD8-IL-17A+) 的比例变化,可显示 hMSCs 有效抑制 Th1 和 Th17,抑制率均可达 40% 以上 ( 见图 3) 。


人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图3) 

hMSCs 促进 Treg 淋巴细胞亚群增殖效应的评价: 利用 hMSCs与异体人PBMC共 培养后,分析CD25 +CD127-细胞亚群( Treg 亚群) 的比例变化,可显示 hMSCs显著增加 Treg 亚群比例,效率可达40%以上(见图4) 。


人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图4)


1.2.2 hMSCs 调控免疫细胞释放炎症因子活性的评价  经 hMSCs 抑制的促炎因子包括 IFN-γ,TNF-α和 IL-17A 等,而经 hMSCs 刺激上调的抑制性因子包括 IL-10,IL-4 和 TGF-β等。通过 hMSCs 与免疫细胞共培养,然后利用 ELISA 方法对培养上清中的特定因子( 如 TNF-α 和 IL-10) 进行检测(见图 5) 。


人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图5)


1.2.3 hMSCs 表达免疫活性分子功能的评价  hMSCs 在静息状态或在炎症因子诱导作用下,可通过表达多种免疫活性分子参与调控免疫反应。IDO1 是 hMSCs 发挥免疫抑制功能的关键分子。PGE2 是参与 hMSCs 抑制 T 淋巴细胞增殖、调节淋巴细胞亚群分化和巨噬细胞极化等功能的重要活性分 子。此外,程 序 性 死 亡 受 体-配 体 1 ( programmed death ligand-1,PD-L1 ) ,血红 素 氧 合 酶-1( heme oxygenase 1,HO-1) ,IL-10,肿瘤坏死因子诱导蛋白 6( TNF-α-stimulated gene 6,TSG-6) 等也是介导 hMSCs 调节免疫反应的重要活性分子。


hMSCs 释放 IDO1 效应的评价: 在评价 hMSCs分泌 IDO1 效应时,需用 IFN-γ 预处理 hMSCs,通过化学吸光度法检测培养上清中代谢产物犬尿氨酸的含量,间接评价 IDO1 的分泌水平(见图 6) 。


人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图6)


hMSCs 释放 PGE2 功能的评价: 在评价 hMSCs 释放 PGE2 功能时,可直接利用 ELISA 法检测 hMSCs 培上清中 PGE2 的含量。我们以往的研究发现,不同个体、不同组织来源的 hMSCs 在 PGE2 的分泌量上差异很大,在 0.05 ~ 200 ng·mL-1


hMSCs 表达 PD-L1 效 应 的 评 价: 静 息 状 态 的hMSCs 可以表达少量的 PD-L1,而经炎症细胞因子IFN-γ 刺激后 PD-L1 的表达量会明显上调(见图7)。


人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图7)

1.3

hMSCs 的组织再生功能



组织再生功能是指受损的组织细胞在经历损伤及炎性反应后所表现的修复或愈合过程。hMSCs 的生物学有效性三方面功能都以不同形式和不同程度参与组织细胞再生过程。hMSCs 的组织再生功能主要表现为保护组织细胞抗凋亡损伤、促血管形成、促进巨噬细胞从 M0 /M1 型向 M2 型极化、促进组织内源性干细胞或前体细胞增殖和分化、促进已分化的组织细胞发生跨系分化( trans-differentiation) 以代偿损伤的组织细胞等。

1.3.1 hMSCs 旁分泌( paracrine) 功能  hMSCs 可通过分泌各种促进组织细胞增殖、保护组织细胞抗凋亡损伤和促进血管形成的细胞因子,共同促进组织再生,其功能可归纳为旁分泌( paracrine) 功能,而旁分泌相关的细胞因子包括肝细胞生长因子( hepatocyte growth factor,HGF) 、白细胞介素 6( interleukin6,IL-6) 、胰岛素样 生 长 因 子-1 ( insulin like growth factor,IGF-1) 、神经 营 养 因 子( glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF) 、血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF) 、成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor,FGF) 、促血管生成素1/2( angiopoietin 1 /angiopoietin 2,Ang 1 /Ang 2) 等因子,以及传统的趋化因子,如基质细胞衍生因子-1( stromal cell derived factor 1,SDF-1) 和单核细胞趋化蛋白-1 ( monocyte chemotactic protein-1,MCP-1 )等。其中,FGF,VEGF 和 Ang 1 /Ang 2 具有较强的促进细胞增殖和血管生成作用; BDNF,GDNF 和IGF-1 可促进神经细胞增殖分化; HGF 具有促进血管生成、细胞再生、抗细胞凋亡等多种功能; IL-6可通过激活 STAT3 上调 HGF 参与抗凋亡功能和促进 M2 巨噬细胞极化; IGF-1 是 hMSCs 促进肾小管上皮细胞增殖和治疗急性肾损伤的关键分子;SDF-1 /CXCR4 可介导内源性干细胞向损伤部位迁移、增殖和促进 hMSCs 自我更新。

hMSCs 分泌 IL-6 和 HGF 功能可通过 ELISA 方法进行检测和评价。以往的研究发现,不同个体、不同组织来源的 hMSCs 在 IL-6 和 HGF 的分泌量上差异很大,IL-6 分泌量在 0.3 ~ 3.0 ng·mL-1,而 HGF 在0.1~ 10 ng·mL-1

1.3.2 hMSCs 抗凋亡功能的评价  将人肺上皮NCI-H1703 细胞培养 24 h 后换为新鲜培养基( 对照培养基) 或 hMSCs 条件培养基,同时加入凋亡诱导剂处理,用流式细胞术分析细胞凋亡情况。由图 8 所示,hMSCs 条件培养基可明显抑制凋亡诱导剂( gamma secretase inhibitor,GSI) 诱导的 NCI-H1703 细胞凋亡。

人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图8) 


1.3.3 hMSCs 促血管形成能力评价  hMSCs 的促血管形成能力可用经典的血管形成试验进行评价。如图 9 所示,hMSCs 条件培养基可明显促进人脐静脉内皮细  ( Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC) 血管样结构的形成。

人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图9) 

1.3.4 hMSCs 促进巨噬细胞由 M0 型向 M2 型极化效应的评价  向 M0 型巨噬细胞( 人单核细胞诱导分化而来) 中加入一定数量的 hMSCs 共培养 3 d后,检测 CD14 + 细胞中 CD206 + 细胞( 即 M2 型巨噬细胞) 的比例变化。如图 10 显示,hMSCs 可明显促进巨噬细胞由 M0 型向 M2 型极化。

人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图10) 


2

hMSCs 生物学有效性评价规范


hMSCs 生物学有效性是所有不同组织来源hMSCs 综合质量要求的重要组成部分,对生物学有效性中各关键质量属性的有效评价是保障 hMSCs综合质量要求的重要内容,而所有关键质量属性的评价技术、质量标准和评价规范构成了 hMSCs 生物学有效性的综合评价体系。


质量评价规范是为满足相关产品特定研发阶段或特定产品形态所需达到的质量控制目标所设立,由特定的质量属性内容、质量属性评价技术和指导评价技术合理使用的评价策略所组成。我国 2015年 8 月推出的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则( 试行) 》( 简称《指导原则》) 提出了 2 种主要的干细胞质量评价规范,即“质量检验”和“放行检验”。


干细胞“质量检验”( 也称“全检”) ,是以一定数量独立批次的终末细胞制剂为评价内容,用于对整个制备工艺的质量及稳定性进行验证的综合性质量评价规范。“质量检验”涵盖“四大类”质量属性评价内容,它们分别是基本生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性及生物学有效性。其中与 hMSCs“质量检验”相关的生物学有效性质量属性评价内容,应包含本文所讨论的“三大类”内容: ① 多向分化潜能,以成骨、成脂、成软骨诱导分化功能为代表。② 免疫调控功能,以总淋巴细胞增殖抑制、抑制 Th1 /Th17 细胞亚群和促进 Treg 细胞亚群、抑制TNF-α 炎症因子释放和分泌 IDO1 等免疫调节分子为代表。③ 组织再生功能,以抗凋亡、促血管形成、分泌各种促进组织再生的活性因子( 如 HGF 和 IL6) 、促进 M2 巨噬细胞极化等功能为代表。


hMSCs 的“放行检验”是在“质量检验”的基础上,以每一制备批次的中间细胞产品或终末细胞制剂为评价对象,选择最具代表性的关键质量属性和相应的“替代性”评价技术,进行相对简易快速但同时又具有代表性的质量评价。如中间产品的放行检验,可选择成骨细胞分化能力( 传统的染色法和/或“替代性分子标志物”检测) 、抑制 Th1 淋巴细胞亚群增殖( 细胞共培养结合流式细胞技术) 和/或“替代性分子标志物”检测( 如用化学吸光法检测 IDO1代谢产物犬尿氨酸的含量) 、抗凋亡功能( 如以 HGF分泌水平为替代性检测方法) 和促血管形成能力( 如以 VEGF 分泌水平为替代性检测方法)。“通用型 hMSCs”的“质量检验”和中间产品“放行检验”评价内容见表 1。

人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图11)


3

讨论


本文中所提出的 hMSCs 生物学有效性评价内容和评价技术,是基于现阶段国际上对 hMSCs 相关知识和技术的共识所提出的,充分体现了相关领域在 hMSCs 生物学有效性认识上的不断演进,以及将新的共识纳入到 hMSCs“关键质量属性”内容和不断补充完善生物学有效性质量评价体系建设的基本思路。


早期研究认为,MSCs 所具有的“干性”或“分化潜能”是 hMSCs 各种临床疗效的关键细胞生物学机制。因此,国际细胞治疗协会( International Societyfor Celluar Therapy,ISCT) 于 2006 年提出将成骨、成脂和成软骨细胞的分化能力作为不同组织来源 hMSCs 的基本的质量标准之一。然而,新的研究成果提示,hMSCs 独特的免疫调控功能是其治疗各种疾病的重要细胞生物学基础,并且 ISCT 的 hMSCs研究小组又于 2013 年提出了应在不同组织来源的hMSCs 生物学效应评价中纳入对其免疫调控功能的评价。


hMSCs 促进组织再生的功能是基于其分泌各类生长因子或活性分子的“旁分泌”( paracrine) 机制。随着对各类细胞“外泌体”( exosomes) 的结构及功能研究不断扩展,人们对 hMSCs“旁分泌”机制的认识又有了新的变化,即从独立因子分泌的形式向集群式或亚细胞结构形式的演变。未来应依据对 hMSCs“外泌体”的研究进展,将“外泌体”的结构与功能的分析纳入到 hMSCs 产品或其衍生产品( “外泌体”产品) 组织再生功能质量评价中。


从监管方面,本文所提出的内容也符合现阶段我国和国际上对治疗性细胞产品质量控制的要求,其具体内容和原则也与相关细胞产品技术性指导原则相一致。我国 2015 年推出的《指导原则》明确提出了“质量检验”和“放行检验”的检验规范和目的,这 2 种规范都不同程度地包含了生物学有效性的内容。原则上,本文相关内容与国际上细胞产品临床研究申报( IND) 所需药学部分( chemistry,manufacturing and control,CMC) 信息原则上也是一致的。IND 所需“CMC”内容,包含对产品工艺验证的信息,类似于《指导原则》中的“质量检验”,和对不同批次产品“放行标准”,类似于《指导原则》中的“放行检验”内容。


依据 FDA 细胞产品“CMC”指导原则,用于生物学有效性的评价技术要有合适的对照、标准物质和可接受的标准。然而,由于获得适用于细胞产品质量分析的标准物质( 如标准细胞株) 非常困难,以及其他变异因素( 如细胞个体的差异、制备技术的差异、评价方法的差异) ,现阶段提出具有普遍意义的标准物质,并在相关标准物质基础上建立各关键质量属性可接受的质量标准仍存在巨大挑战,未来这些问题的解决需完全依赖严格的 hMSCs 质量标准研究。


另外,本文所提出的技术评价体系适用于“通用型 hMSCs”质量评价,其基本原则也应适用于各种特殊处理和“临床适应证”相关的 hMSCs。在设计和开展针对后者的质量评价时,需充分考虑相关产品和临床适应证的特殊性,从已有的评价体系中衍生或建立新的评价内容和评价技术。


总之,随着 hMSCs 的临床研究不断发展,提高干细胞产品临床前研究阶段生物学有效性质量评价能力,已成为影响产品研发和产业发展至关重要的环节。在产品研发的整个周期中,相关细胞产品从产品早期研发、临床前研究、临床研究申报( 注册或备案) 、临床研究结果评价、上市前审批、上市后再评估的过程中,均有不同程度的生物学有效性评价的内容要求,并且随着临床研究从早期向后期不断发展的过程中,对生物学有效性的要求会越来越高。而对于研发者,作为质量评价重要组成部分的生物学有效性内容应该是研发者核心竞争力的重要体现。未来需通过严格的生物学有效性质量标准研究,提高干细胞产品的研发能力和监管水平,进而保障产品质量的有效支撑,推动 hMSCs 产品研发和产业发展。


本文来源:韩晓燕,纳涛,张可华,袁宝珠.人间充质干细胞生物学有效性的质量评价[J].中国新药杂志,2018,27(21):2511-2518.

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人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图12)
END

人间充质干细胞生物学有效性的质量评价(图13)

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