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基因治疗产品安全性监管研究
时间:2021-08-26作者:中检联来源:中检联检测
基因治疗产品(Gene Therapy Product,GTP)是指将基因导入人体后,在体内通过对体细胞的遗传物质进行修饰、改变基因表达方式或调节细胞生物特性以达到疾病治疗目的的药品。GTP通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成,其活性成分可为 DNA、RNA、基因改造的病毒、细菌或细胞等。GTP主要可分为以病毒为载体的GTP、以质粒 DNA为载体的GTP、RNA类GTP,以及以细菌微生物为载体的GTP。GTP是一种全新的产品,可用于多种疾病的治疗,包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等,具有独特性、多样性、技术高度复杂性。

GTP的发展历程不是一帆风顺的,经历了狂热期、十余年的挫败期和再发展时期,也付出了惨重代价;但是,GTP的研发科学家从历次重大事故和灾难中不断总结经验,吸取教训,寻找安全性监管的办法。为确保GTP的安全性,各国(地区)逐步建立和完善了监管法规,目前,全球已有13个GTP用于人类疾病治疗。


基因治疗产品安全性监管研究(图1)



2020年10月7日,瑞典皇家科学院将诺贝尔化学奖授予科学家埃玛纽尔·夏彭蒂耶(Emmenuelle Charpentier) 和 詹 妮 弗 · 杜 德 纳 (Jenmfer Doudna),她们发明了一种基因组编辑技术,即基因剪刀(Clustered Regulerty Interspaaced Short Palindromic Repeats/Cas9,CRISPR/Cas9),应用这一技术可以精确、简单、廉价、高效地改变动物、植物、微生物的DNA序列,为基因治疗带来了革命性变化,使基因治疗不再是遥不可及的技术,为癌症、遗传疾病等治疗提供了无限的潜力。
1 GTP非临床安全性评价关注点


1.1 非临床试验原则

在GTP的开发过程中,非临床试验的目的是获得产品应用于人体的风险和效益的大量信息,支持GTP的临床试验及上市注册申请。GTP的非临床药理毒理学评价应遵守以下原则:

(1)具体问题具体分析;

(2)GTP非临床开发根据具体产品种类、可获得的相关动物模型、临床用途和适应症、拟给药途径和治疗方案等决定;

(3)根据风险关注点设计适当的评价指标;

(4)根据载体类型选择合适的对照组,如设置无目的基因的载体、空载体对照组或者设置无功能目的基因的载体作为对照组;

(5)使用相同动物模型进行毒理学和药代动力学研究;

(6)关键性非临床安全性试验必须符合GLP要求。

1.2 基因载体的安全性问题

1.2.1 腺病毒

腺病毒(Adeoviru,AV)是基因治疗常用载体,AV作为载体的安全性风险主要包括:

(1)AV载体免疫原性强,体内注射能引起较强的免疫反应;

(2)靶向性差,可以感染所有的细胞;


(3)转基因表达水平较低,持续时间短。1999年,人类第一例基因治疗死亡病例杰西,因AV载体导致免疫系统强烈反应,造成IL-6和TNF瀑布式分泌所致。
1.2.2 逆转录病毒


逆转录病毒(Ratrovirus,RV)载体,对灵长类具有致病性,安全性风险主要包括:

(1)有复制能力的RV感染人体;

(2)RV能与宿主细胞基因组整合,可以整合到基因5'-非编码区,干扰宿主细胞正常的基因表达;甚至导致插入突变而致癌;

(3)无关核酸系列转移至靶细胞。尽管科学家已经对逆转录病毒进行了一系列的改造,尽可能地降低其对细胞的毒性,但只要病毒仍具有感染细胞、整合到宿主基因组的能力,即会对宿主细胞的正常生理功能产生不同程度的影响,存在一定的潜在风险。同时,改造后的工程病毒仍属于病毒的范畴,故而存在免疫原性,容易诱发人体的免疫反应,过度的免疫反应会对人体造成不可逆的损伤甚至死亡。


1.2.3 腺相关病毒


腺相关病毒(Adeo-assiciated Virus,AAV)载体,AAV无致病性,免疫原性低,无插入突变或致癌风险。具有病毒载体的病毒毒性、免疫原性、目的基因的表达量与正常状态不同的缺点。


1.2.4 慢病毒


慢病毒(Lentivirus,LV)载体安全性问题包括:

(1)具有复制能力;

(2)插入位置在或接近原致癌基因,有致癌风险。慢病毒的基因组通常整合到宿主细胞基因组的编码区,而且是随机插入、专一性不强,因此,大大降低了慢病毒基因组集中插入到一个癌症相关基因的附近、激活原癌基因的可能性,从而降低了诱发细胞癌变的风险。慢病毒属于逆转录病毒大类,具备逆转录病毒载体共同的弊端,例如病毒毒性、免疫原性、基因整合引起的宿主基因突变、目的基因的表达量与正常状态不同、细胞感染不具靶向性等。

1.3 基因编辑技术的安全性问题

1.3.1 基因编辑技术可分为3个步骤:

(1)定位异常基因:在DNA上找到需要进行编辑的位置。需要一套精准的定位系统来快速锁定剪切的部位。

(2)切除异常基因片段:通过内切酶把错误的基因片段切除。

(3)修补恢复成正常基因:内切酶把错误的基因片段切除后,会在DNA上形成一段缺口,只需要把对应的正确基因片段插入到这个缺口中并与原DNA进行连接即可完成DNA的修复。


1.3.2基因编辑技术主要类别及安全性问题有:


(1)锌指核酸酶技术(Zinc Finger Nucleases,ZFN),存在脱靶风险,ZFN只通过较短的DNA片段序列来实现锌指核酸酶的定位,而人类基因组DNA的大小约为3Gb,难免会在非靶基因的部位出现部分序列的重叠,导致锌指核酸酶的错误定位,进而产生错误的基因编辑,发生脱靶效应。锌指核酸酶属于外源蛋白,细胞毒性较大,导入患者细胞后会对细胞正常的代谢功能产生一定的干扰。

(2)转录激活样效应因子核酸酶技术(Tranion Activator-Like Effector Nucleases,TALEN)脱靶效应导致的潜在安全风险。


1.3.3 成簇规律性间隔的短回文重复序列技术(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR),2012年由麻省理工大学的华人科学家张峰和加州大学伯克利分校的珍妮弗独立发明。CRISPER系统的DNA定位和剪切元件由Guide RNA(gRNA)和Cas9蛋白组成,gRNA通过碱基互补原则结合到目标DNA上,Cas9也顺势结合发挥剪切活性,进而利用细胞自带的DNA修复系统实现基因编辑。CRISPR还具有基因编辑效率更高、脱靶风险低、操作成本低等多方面的优势。然而,CRISPR技术出现时间还太短,科学家还无法充分预估其潜在风险。2018年1月,斯坦福大学儿科血液学家Matthew Porteus和Kenneth Weinberg领导的研究小组发表论文,报导在70%的人中都发现了Cas9同源蛋白的抗体,而超过一半的人都存在其同源物的抗原特异性T细胞,这意味着CRISPR/Cas9系统进入人体后可能被人体自身的免疫系统清除而失效,甚至有可能会引发人体剧烈的免疫反应。基因编辑技术,特别是CRISPR技术面世的时间还太短,存在太多不确定的因素,再加上科学家对人类基因功能和调控网络的认知还非常不足,轻易改动基因可能引发无法预见的安全问题。而且基因编辑的安全性最大的隐忧来自于脱靶效应,也就是Cas9蛋白和单碱基编辑器打偏了,在其他地方出现了不想要的DNA切割和突变。
1.3.4 脱靶风险检测,杨辉等开发出了脱靶检测技术(Genome-wide Off-target Analysisby Two-cell embryo Injection,GOTI),为通过基因编辑技术的GTP安全性评价提供了新方法。
2 基因治疗产品的非临床评价


2.1 动物模型选择

GTP具有独特生物学活性,应该使用现有可以获得的、最适当的、与药理学作用相关的体内与体外模型进行非临床研究。选择动物模型应考虑:

(1)病毒载体能在该动物模型上有效地转染与复制;

(2)如果病毒/细菌须通过特殊细胞受体进入细胞,必须考虑该受体在该动物模型上的表达量和组织分布;

(3)目的基因的调控因子活性与目的基因如何调控组织表达的特异性及程度;

(4)目的基因的表达产物在动物模型上的生物反应,包括目的基因的表达、分布、受体结合能力、占据受体的时间与对功能的影响等;

(5)动物模型的免疫状态及免疫反应;

(6)如果使用转基因动物模型模拟不同的人类疾病,必须给出选择理由;

(7)检查动物模型的代谢及其他药代动力学参数;

(8)检查病毒载体在动物模型体内的主动或被动分布,以及GTP与宿主内源性病毒发生重组的可能;

(9)GTP的个别成分,在动物模型中的生物特性以及给药剂量与体积的安全性。

2.2 主要药效学试验概念验证研究

概念验证研究(Proof of Concept,POC)的目的是通过体内或体外试验支持临床疗效,提供相关的生物作用/分子作用机制的证据。POC必须能显示出目的基因的表达程度、特异性调控的表达程度、目的基因产物是否正确,以及目的基因产物是否能在适当的靶器官中表达。

2.3 安全药理学研究

GTMP原则上需要进行适当的安全药理学试验(ICHS7A),检测在疗效剂量范围或剂量更高时,对生理功能(包括中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统和其他与该产品生物分布相关研究)潜在的药理学作用。

2.4 药代动力学研究

GTMP的药代动力学研究,主要关注该产品的组织分布、持续性、清除与转移,以及转到生殖系统的风险性。此外,探讨目的基因表达的量、持续时间、表达或释放的靶器官(部位)。

(1)GTMP的生物体内的分布试验,检测在靶器官和非靶器官分布程度,随时间变化的清除。以及检测基因产物的表达量和持续时间。

(2)评价插入基因的情况。如果整个载体(如逆转录病毒或慢病毒)或部分载体预计可能会插入宿主基因组,进行插入试验研究,并关注:①插入发生的组织/器官;②载体插入量及插入宿主基因体的位置;③插入载体的结构完整性,特别关注重新排列或发生的重组事件;④插入载体量的稳定性/持续性;⑤插入正确靶器官的准确性;⑥如果质粒DNA有部分具有插入性,归为插入性载体类。

(3)生殖转导的风险,根据体内生殖系统分布情况,评价生殖系统转导风险。如分析在生殖腺的分布情况,精子与卵子中的分布、精液分布与插入分析。

(4)脱落(Shedding),是指病毒载体分泌及排泄而散播的特性。应用非临床脱落试验评价人体中脱落发生的可能性与范围。

2.5 临床前毒理学研究

研究GTP临床试验时可接受的风险-效益比(Risk-benefit Ratio)。毒理学安全性评价应该能全部识别、描述、量化可能的局部和全身毒性、毒性发作时间、毒性的可逆性,以及在不同剂量观察到的毒性,应该针对GTP的完整产品,包括病毒/载体、目的基因和目的基因表达产物进行毒性评价,以确定载体分布与持续性,载体感染/转导/转染,载体基因的表达和生物活性所造成的不可预测的后果。评价引发免疫反应和不可预测的药理学作用。


2.5.1 单次给药毒性试验


如果GTP临床拟单次给药,应进行扩展的单次给药毒性试验,适当延长给药后的观察时间,并应用重复给药毒性试验的研究指标,如活检、组织病理学、临床生物化学及血液学指标检测,评价毒性持续时间及可逆性。无需以动物死亡为最后评价指标,要特别关注与GTP特性相关的指标,包括体液和细胞免疫反应、载体生物分布及持久性、重要器官/系统的安全性观察,以及输入过程可能的潜在风险等。


2.5.2重复给药毒性试验


如果GTP临床拟多次给药,则应进行重复给药毒性试验,给药方式和时间应反映临床给药方式。GTP毒性试验的时间及恢复期时间长短,取决于GTP的持续时间、表达程度和部位以及潜在风险。


2.5.3 遗传毒性试验


根据GTP的性质,可能需要进行遗传毒性试验,其目的(1)检测是否发生基因修饰现象,检测后续细胞行为的任何异常;(2)评价插入性突变所致的遗传毒性,研究毒性作用机制,评价脱靶修饰(Off-target Modificiation)所致毒性;(3)识别并描述基因插入位置,评价目的基因和邻区序列可能产生的交互作用。对于GTP的遗传毒性问题如插入突变及致癌性,应用相关体内及体外模型评价。标准的遗传毒性试验方法(ICH S2)不适用,但应对该类产品的杂质或载体系统的组分进行遗传毒性评价。


2.5.4 致癌性试验


对GTP一般不需要进行标准的非临床安全性评价及啮齿类全生命周期的致癌性试验。应该根据ICHS6(R1)及ICHS1致癌性指导原则指出的证据权重(Weight of Evidence)方法确定是否进行致癌性试验,应考虑:

(1)药理作用靶点或传递通路信息,如生长因子基因的传递;

(2)作用靶点或传递通路相关机制,以及已知次要药效学是否与致癌性试验结果相关,是否与人潜在致癌基因有关;

(3)插入突变的试验结果;

(4)重复给药毒性试验的组织病理学评价,特别关注细胞肥大、弥漫性或局部细胞增生、持续性组织损伤、慢性炎症、癌症前期变化及肿瘤;

(5)干扰激素分泌的证据;

(6)免疫抑制;

(7)特殊的试验及评价指标。


2.5.5 免疫原性及免疫毒性


将GTMP传输入人体可能会引发天然免疫反应及获得性免疫反应,如产生针对载体与目的基因产物抗体、具有细胞毒性杀伤能力的靶细胞攻击等。此外,还要关注组织交叉反应和自身免疫反应的风险。


2.5.6 生殖及发育毒性


需要考虑产品类型、作用机制、分布和GTP特性及病人群体,依据ICHS5生殖毒性试验指导原则提供的方法评价。为了评价亲代给药是否会传递给子代,需进行繁殖试验,要注意精子生成和卵母细胞成熟的时间。如果有生育能力的女性应用GTP,需进行胚胎发育和围产期前后生殖毒理学实验。


2.5.7 局部耐受性试验


根据GTP的类型、给药途径及程序(如经口给药、肌肉注射、静脉注射、肿瘤内注射等),有必要进行局部耐受性试验,可以结合在一般毒性试验中评价。


2.5.8 药物相互作用


如果GTP与其他药物同时应用,可能会影响载体的转染/转导/感染、载体趋向性和效果、目的基因表达、表达产物的生物活性、以及载体的组织分布。因此,有必要研究药物的相互作用,例如应用免疫抑制剂可能改变病毒载体的清除等。


2.5.9 药物非临床试验质量管理规范(Good Laboratory Practice,GLP)
根据GLP的规定,所有非临床安全性试验均应遵守GLP规定。但是,体外和体内药理学/POC研究不要求一定遵守GLP。同样,对毒理学试验中某些非常规指标如载体生物分布、细胞动力学或特定免疫指标,GLP试验机构可能无法提供所需的检测仪器和技术,则可以在非GLP条件下开展。


GTP是高期望值与高风险性共存的一类产品,主要关注的问题应该是安全性。人们对基因和疾病的认知还存在很多盲区,且基因改造后通常难以逆转,潜在风险较大;而传统的药物治疗大多已经历了几十年甚至上百年的发展和使用,风险相对可控,因此,基因治疗更多地是作为常规治疗方案的补充。


参考来源:张军,李笑蕾,任跃明.中国与欧盟、美国基因治疗产品安全性监管研究[J].中国药事,2021,35(04):368-379.




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